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人胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書

更新時(shí)間:2023-03-29      瀏覽次數(shù):1205

人胰島素(INS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書

實(shí)驗(yàn)原理 

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 。往預(yù)先包被有人胰島素(INS) 捕獲抗體的微孔中, 依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測抗體,HRP 酶結(jié)合物,中間經(jīng)過溫育和洗滌,用底物 TMB 顯色,TMB 在過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素  (INS) 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度 (OD ) ,計(jì)算樣品濃度。

操作步驟 

1.  從室溫平衡 10 分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  加樣:分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照 100 μ l 每孔加入相應(yīng)孔中,空白孔加入 100μL 通用稀釋液。蓋 上封板膜后 37℃溫育 1 小時(shí)。  (建議:將待測樣本用通用稀釋液稀釋 1 倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測試。 減少基質(zhì)效應(yīng)對測試結(jié)果的誤差影響,最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測樣本和 標(biāo)準(zhǔn)品在檢測中建議設(shè)立復(fù)孔) 。

3.  加生物素化抗體:取出酶標(biāo)板,棄去液體,不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液 100 μL,蓋上  37℃溫育 1 小時(shí)。

4.  洗板:棄去液體,每孔加入 300 μL 1x 洗滌液,靜置 1 分鐘,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板

3 次 (也可用洗板機(jī)洗板)

5.  加酶結(jié)合物工液:每孔加入酶結(jié)合物工作液 100 μL,蓋上封板膜后 37℃溫育 30 分鐘。

6.  洗板:棄去液體按步驟 4 洗滌方法,洗板 5 次。

7.  加底物:每加入底物(TMB)90 μL,蓋上封板膜,37℃避光溫育 15 分鐘。

8.  加終止液:取出酶標(biāo)板,每孔直接加入終止液 50 μL,立即在 450nm 波長處測定各孔的OD 。



結(jié)果判斷:

1.  計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均 OD 值并減去空白孔的OD 值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo),OD 值為縱坐標(biāo), 雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。

2.  若樣品OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

型數(shù)據(jù)和參考曲線:

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考,實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

image.png

 

 

 (ng/mL)

10

5

2.5

1.25

0.625

0.312

0. 156

0

OD 

2.22

1.56

0.92

0.63

0.42

0.25

0. 18

0.08

OD 

2. 14

1.48

0.94

0.55

0.34

0. 17

0.1

 

-





盒性能 

1.  重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于 10%,板間變異系數(shù)小于 10%。

2.  回收率:在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入 3 個(gè)不同濃度水平的人 INS,計(jì)算回收率

 

本類型

均回收率

 (n=8)

84- 101

96

漿(n=8)

92- 105

102

細(xì)胞培養(yǎng)上清(n=8)

96- 108

105

 

 

3.  線性稀釋:分別在選取的 4 份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人 INS,在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍

內(nèi)進(jìn)行稀釋,評估線性。評估線性。

本試劑只能用于科學(xué)研究,不得用于醫(yī)學(xué)診斷          6


 

 

稀釋比

收率  (%)

漿

細(xì)  培養(yǎng)

1 2

 (%)

84-95

88-96

90- 110

均回收率  (%)

91

93

96

1 4

 (%)

89- 103

87- 108

105- 115

均回收率  (%)

94

98

108

注意事項(xiàng)

1.  嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫 20-25℃ 。使用

后立即冷藏保存試劑。

2.  洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3.  消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD 值。

4.  底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

5.  避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。

6.  在儲存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7.  平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8.  任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑

的生物活性。

9.  不能使用過期產(chǎn)品。

10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。


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